مقدمه ای درباره رنگ آمیزی آلسین بلو در پاتولوژی
یکی از رنگ‌ آمیزی های اختصاصی در بافت شناسی (پاتولوژی) تشخیصی و تحقیقاتی، روش رنگ آمیزی آلسین بلو یا آلسیان بلو (Alcian blue) است. آلسین بلو یک مولکول رنگ بزرگ است که از یک حلقه مرکزی فتالوسیانین (Pthalocyanine) حاوی مس تشکیل شده است که از طریق پیوندهای تیواتر Thioether به چهار گروه ایزوتیورونیوم متصل شده است. گروه‌های ایزوتیورونیوم پایه‌ های نسبتاً قوی هستند که ماهیت کاتیونی آلسین بلو محسوب می شوند. آلسین بلو گروهی از رنگهای پایه چند ظرفیتی محلول در آب هستند که رنگ آبی آن ها به دلیل وجود مس است. در بافت شناسی، آلسین بلو هم موکوپلی ساکاریدهای اسید سولفاته و کربوکسیله و هم سیالوموسین های سولفاته و کربوکسیله (گلیکوپروتئین) را با ایجاد پیوندهای نمکی با گروه‌های اسیدی آنها، رنگ می کند.

تاریخچه رنگ آمیزی آلسین بلو
آلسین بلو در ابتدا در دهه ۱۹۴۰ میلادی در صنایع شیمیایی انگلیس تولید شده و برای رنگ‌ آمیزی الیاف در نساجی استفاده می شد. انواع مختلفی از رنگ‌ های آلسین بلو در گذشته تولید شده‌اند که از نظر تعداد گروه‌ های ایزوتیورونیوم مرتبط و همچنین اجزای رقیق‌ کننده متفاوت هستند. استفاه از رنگ آلسین بلو برای اهداف بیولوژیکی در دهه ۱۹۵۰ میلادی آغاز شد. محققی به نام استیدمن Steedman آلسین بلو را برای رنگ آمیزی غضروف و موسین استفاده نمود و در نهایت منجر به تنظیم رنگ Alcian Blue 8GX برای رنگ آمیزی موسین ها در نمونه های بافتی در پاتولوژی شد.

انواع کاربردهای رنگ آمیزی آلسین بلو در پاتولوژی
آلسین بلو در پاتولوژی برای تشخیص موسین‌ های اسیدی استفاده می‌ شود که توسط تومورهای مختلف بافت همبند و اپیتلیال ترشح شوند. رنگ آلسین بلو بیشتر در نمونه‌ های بافتی از دستگاه گوارش استفاده می‌ شود و در تشخیص فرآیندهای پاتولوژیک مانند Barrett’s esophagus مفید است.
استفاده از محلول های آلسین بلو با pH های مختلف (۱.۰ و ۲.۵) نیز به تمایز انواع مختلف مواد مخاطی اسیدی کمک می کند.

نگاهی اجمالی به موسین رنگ شده با آلسین بلو
موسین ها گلیکوپروتئین‌ هایی با وزن مولکولی بالا هستند که در اپیتلیوم دستگاه گوارش، تنفس و تولید مثل پراکنده هستند. موسین ها از یک هسته پروتئینی مرکزی با زنجیره های متعددی از کربوهیدرات (پلی ساکارید) به هم متصل، تشکیل شده‌اند. محتوای کربوهیدرات موسین ممکن است ۶۰ تا ۸۰ درصد وزن مولکولی آن را تشکیل دهد. هسته پروتئین حاوی مقادیر بالایی از اسیدهای آمینه سرین و ترئونین (threonine) است. ساختار تعیین کننده موسین ها، وجود تکرارهای پشت سرهم از توالی‌ های اسید آمینه خاص در هسته پروتئین می‌ باشد. از دیدگاه مولکولی، موسین ها بر اساس تفاوت در توالی و اندازه تکرارهای پشت سر هم به خانواده های مجزا (Muc 1، Muc 2، Muc 3، و غیره) طبقه بندی می‌ شوند.

از دیدگاه هیستوشیمیایی بافت ها، موسین ها را می توان در یکی از دو گروه کلی بر اساس شیمی و ترکیب اجزای کربوهیدرات موسین قرار داد. موسین های باردار یا “اسیدی” حاوی کربوهیدرات هایی با گروه‌های کربوکسیلات (COO) یا سولفونات (SO3) هستند. هر دو گروه در pH فیزیولوژیک یونیزه شده و بار موسین منفی می شود. زنجیره‌های کربوهیدراتی موسین‌ های خنثی فاقد گروه‌ های اسیدی هستند و بنابراین بار خالصی ندارند. موسین‌های خنثی عمدتاً در اپیتلیوم سطحی معده، غدد برونر (Brunner’s glands) دوازدهه و در اپیتلیوم پروستات یافت می شوند.

انواع نمونه‌ های بافتی تشخیصی و مورد مطالعه با رنگ‌ آمیزی آلسین بلو
در رنگ‌ آمیزی آلسین بلو، بافت هایی که در حالت توموری تولید موسین ها را به همراه دارند، مورد مطالعه قرار می گیرند. این نمونه‌ های بافتی عبارتند از بخش‌ های مختلف دستگاه گوارش مانند روده کوچک، معده، آپاندیس، بیوپسی پستان، ریه، بخش هایی از دستگاه تولید مثل مانند پروستات رنگ‌آمیزی می‌ شوند.

پروتکل رنگ‌آمیزی آلسین بلو در پاتولوژی
دستورالعمل رنگ آمیزی آلسین بلو برای نمونه های بافتی همانند اکثر رنگ آمیزی های اختصاصی دیگر شامل دو مرحله کلی آماده سازی لام و رنگ آمیزی نمونه بافتی می‌ باشد.

مراحل آماده سازی لام از نمونه بافتی در رنگ‌ آمیزی آلسین بلو
هنگامی که نمونه مورد بررسی بافت است ابتدا می بایست بافت طی یک سری مراحل فیکس گردد.

آبگیری بافت: فرایند آبگیری بافت با غوطه‌ ور کردن بافت ها در اتانول انجام می شود. اتانول جایگزین آب در سلولهای نمونه بافتی می شود. از افزایش غلظت اتانول (معمولاً از ۷۰ تا % ۱۰۰) در این مراحل استفاده می‌ شود.
قالب‌گیری بافت: بعد از آبگیری، پارافین مذاب با دستگاه پارافین دیسپنسر در تیشوبسکت ها می ریزیم. تکه های بافت را در تیشوبسکت حاوی پارافین مذاب قرار داده و قالب گیری کرده و اضافه های پارافین را حذف می‌ کنیم نهایتاً بلوکهای پارافینی جامد از بافت داریم. پس از خنک شدن پارافین، قالب نمونه را در آب فرو می بریم. نهایتاً پارافین که منجمد شد می بایست آن را از قالب جدا کنیم.
برش‌ گیری از بلوک پارافینی: در این مرحله از نمونه پارافینی با دستگاه میکروتوم به کمک تیغ میکروتوم برشهای نازک در حد ۳-۵ میکرون تهیه می کنیم.
آبدهی نمونه برش زده: برش‌ های نمونه بافتی را روی لام قرار داده و سپس پارافین های اضافی نمونه ها را با دستگاه گرمکن اسلاید حذف می کنیم و با غلظت های مختلف از اتانول نمونه ها را آبدهی می‌ کنیم.
اکنون لام های آماده شده را طبق پروتکل رنگ آمیزی رنگ می‍ کنیم.

مراحل رنگ آمیزی نمونه بافتی در رنگ آمیزی آلسین بلو
pH محلول رنگی آبی آلسیان (آلسین بلو) برای شناسایی بیشتر زیرگروه‌های موسین‌ های اسیدی موجود در یک نمونه بافتی بسیار پراهمیت و مهم است.

ابتدا محلول رنگی آلسین بلو با pH مورد نظر طبق فرمولاسیون زیر به صورت زیر تهیه می کنیم.

محلول آلسین بلو pH:2.5 (1% آلسین بلو در ۳% استیک اسید آبی): یک گرم آلسین بلو ۸GX در ۹۷ سی‌ سی آب مقطر حل نموده و ۳ سی‌ سی استیک اسید گلسیال به ترکیب اضافه می نماییم و نهایتاً محلول رنگی را با کاغذ صافی واتمن فیلتر کرده و در ظرف تیره نگهداری می کنیم.

محلول آلسین بلو pH:1: یک گرم آلسین بلو را در ۹۰ سی‌ سی آب مقطر حل نموده و ۱۰ سی‌ سی هیدروکلریک اسید یک نرمال اضافه می کنیم و پس از فیلتر نمودن در ظرف تیره نگهداری می شود.

محلول آلسین بلو pH:2: یک گرم آلسین بلو در ۱۰۰ سی‌ سی از سولفوریک اسید ۱۰ درصد حل می کنیم و پس از فیلتر محلول، در ظرف شیشه‌ ای تیره نگهداری می کنیم.
لام های تهیه شده از نمونه بافتی مورد نظر را به مدت سه دقیقه در استیک اسید ۳% قرار داده و سپس با آب مقطر شستشو می‌ دهیم.
لام‌ ها را با محلول آلسین بلو به مدت ۱۵ الی ۳۰ دقیقه رنگ می‌ کنیم. جار رنگ آمیزی را از محلول رنگ پر نموده تا رنگ آلسین بلو کاملاً سطح لام را بپوشاند.
بعد از رنگ آمیزی، لام ها را ۵ دقیقه با آب جاری شستشو می دهیم تا رنگ‌های اضافی حذف گردد. توجه داشته باشیم که در رنگ آمیزی با رنگ دارای pH کمتر از ۲، شستشوی مختصر داشته باشیم که رنگ از لام کاملاً حذف نشود.
لام ها را با آب مقطر به مدت کمتر از ۵ ثانیه غوطه‌ور می شوند.
به سرعت لام های میکروسکوپی رنگ آمیزی شده را با اتانول مطلق دهیدراته نموده و با چسب انتلان و لامل، نمونه را روی لام مونت می‌ کنیم و با میکروسکوپ نوری نمونه های فیکس و رنگ شده را بررسی می کنیم.

تجهیزات و مواد آزمایشگاهی مورد نیاز برای رنگ آمیزی آلسین بلو
 

مواد مورد نیاز

اتانول مطلق
پارافین
آب مقطر
استیک اسید گلسیال
چسب انتلان
زایلین
سولفوریک اسید
هیدروکلریک اسید

تجهیزات مورد نیاز

میکروسکوپ نوری
پارافین دیسپنسر
دستگاه میکروتوم و تیغ میکروتوم
دستگاه گرمکن اسلایید
جار رنگ‌ ­آمیزی لام و سبد رنگ آمیزی لام
لام و لامل
کاغذ صافی واتمن
ظرف شیشه ­‌ای تیره

تفسیر نتایج رنگ آمیزی آلسین بلو
رنگ آمیزی پلی ساکاریدهای اسیدی با آلسین بلو برای تشخیص و شناسایی موسین‌ های اسیدی اپیتلیال و بافت همبند استفاده می شود. موسین‌ ها نوعی کربوهیدرات هستند و در دستگاه گوارش و دستگاه تنفسی یافت می شوند. موسین های اسیدی بار منفی دارند. مولکول رنگ آلسین بلو دارای یک حلقه فتالوسیانین حاوی مس است که به چهار گروه ایزوتیورونیوم که دارای بار مثبت هستند، مرتبط است. مولکول رنگ با گروه‌ های گوگرد و یا کربوکسیل موسین بسته به pH مورد استفاده متصل می شود. pH تعیین می کند که کدام موسین رنگ آمیزی شده است. با محلول اسید استیک ۳ درصد با pH 2.5، موکوپلی ساکاریدهای اسید سولفاته و کربوکسیله و گلیکوپروتئین‌ ها را رنگ می کند. در pH 1.0 فقط موکوپلی ساکاریدهای اسید سولفاته را رنگ می کند، بنابراین موسین های بسیار اسیدی‌ تر هستند. رنگ آبی توسط مس موجود در مولکول رنگ ایجاد می شود.

آلسین بلو با pH 2.5 برای تشخیص مری بارت (Barrett’s esophagus) استفاده می‌ شود، زیرا سلولهای ترشحی جامی شکل (Goblet) را نیز رنگ آمیزی می کند. آلسین بلو موسین های اسیدی را آبی رنگ می کند اما موسین‌ های خنثی را رنگ نمی‌ کند. اگر می‌ خواهید موسین‌ های خنثی را نیز بررسی کنید، آلسین بلو را می‌ توان با رنگ PAS، که موسین‌ های خنثی را ارغوانی رنگ می‌ کند، استفاده نمود. سلول‌ هایی که دارای موسین اسیدی و خنثی هستند ممکن است به رنگ آبی تیره یا بنفش ظاهر شوند.

جمع بندی
جداسازی و شناسایی موسین ها برای دستیابی به دانش و آگاهی در مورد آسیب شناسی مولکولی بیماری‌ های مختلف از جمله سرطان‌ ها و فیبروز سیستیک بسیار مهم است. ترکیبی از تکنیک‌ های آلسین بلو و پاس می‌ تواند به عنوان تکنیکی برای تشخیص موسین‌ های خنثی از موسین‌ های اسیدی استفاده شود. در اکثر پروتکل ها، نمونه های بافتی با روش استاندارد آلسین بلو (pH 2.5) رنگ آمیزی می شوند که نیز به دنبال آن از رنگ پاس هم استفاده می شود. کاربرد ترکیبی آلسین بلو و پاس شاید حساس‌ ترین یا جامع‌ ترین روش برای تشخیص موسین ها باشد، زیرا همه موسین‌ ها در یک نمونه همزمان باید بدون درنظر گرفتن ماهیت بار بررسی و مطالعه شوند.

سوالات متداول
❔ موسین ها با رنگ آلسین بلو در pH:2.5 ، چه رنگی مشاهده می شوند؟
✔️ موسین های اسیدی با رنگ آمیزی آلسین بلو آبی پررنگ هستند.

❔ چرا در تشخیص سرطان‌ های دستگاه گوارش از رنگ‌آمیزی آلسین بلو استفاده می‌شود؟
✔️ تومورهای دستگاه گوارش موسین‌ های گلیکوپروتئینی را ترشح می‌ کنند که با رنگ‌ آمیزی آلسین بلو تشخیص داده می‌ شوند.

❔ کدام رنگ آمیزی اختصاصی را می‌ توان همزمان با رنگ آمیزی آلسین بلو برای مطالعه موسین‌ ها انجام داد؟
✔️ رنگ‌ آمیزی پریودیک اسید شیف یا پاس و آلسین بلو را همزمان برای رنگ آمیزی موسین‌ ها می‌ توان استفاده نمود.