رنگ‌آمیزی رتیکولین (Reticulin)
رنگ رتیکولین فیبرهای رتیکولین که با روش رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین (H&E) قابل مشاهده نیستند را رنگ می کند. الیاف رتیکولین آژیروفیلیک (agyrophilic) هستند، بنابراین این الیاف در نمونه های بافتی با استفاده از یک کاهنده شیمیایی، با محلول نقره سیاه رنگ می شوند که در نتیجه این فیبرها را به صورت قابل مشاهده در می آورد. انواع مختلفی از روش های رنگ آمیزی رتیکولین مانند Gordon & Sweets, Wilder, Gridley, Snook, Laidlaw, and Gomori وجود دارد که با این حال، تمام این روش ها مراحل رنگ آمیزی یکسانی دارند و الیاف رتیکولین را رنگ می کند.
کاربردهای رنگ‌آمیزی رتیکولین در پاتولوژی
فیبروز یا تشکیل بیش از حد بافت فیبروزی معمولاً در نمونه های بیوپسی مغز استخوان که دارای اختلالات میلوپرولیفراتیو (Myeloproliferative) مانند پلی سیتمی ورا (Polycythemia Vera)، میلوفیبروز اولیه یا ایدیوپاتیک (primary or idiopathic myelofibrosis)، ترومبوسیتوز ضروری (essential thrombocytosis)، لوسمی میلوئید مزمن (chronic myeloid leukemia) با رنگ آمیزی رتیکولین نشان داده می شود. علاوه بر این، فیبروز را می توان در نمونه های مغز استخوان که متاستاز تومور قابل توجهی دارند، مشاهده کرد. از آنجایی که چندین وضعیت پاتولوژی نئوپلاستیک و غیرنئوپلاستیک می تواند با افزایش فیبروز رتیکولین همراه باشد، پاتولوژیست باید مطمئن باشد که هم کمیت و هم ضخامت الیاف را ارزیابی می کند.
نگاهی اجمالی به فیبرهای رتیکولین رنگ شده با رتیکولین
اجزای فیبری ماتریکس خارج سلولی از نظر آنالیز میکروسکوپ نوری به سه نوع فیبر طبقه بندی می شوند: کلاژن، رتیکولار و الاستیک. رشته های رتیکولین نوعی فیبر در بافت همبند است که از کلاژن نوع III که توسط سلول های شبکه ای یا رتیکولار ترشح می شود، تشکیل شده است. از نظر میکروسکوپ الکترونی، الیاف رتیکولین به صورت منفرد یا دسته کوچکی از فیبری ل‌ها مشاهده می شوند، اگر چه قطر فیبریل‌ها نازک (حدود ۳۰ نانومتر) و یکنواخت است. فیبرهای رتیکولار از طریق فیبریل ها با فیبرهای کلاژن متصل هستند. الیاف رتیکولین به صورت متقاطع به هم متصل می شوند تا شبکه ای ظریف (رتیکولین) را تشکیل دهند. این شبکه به عنوان یک شبکه پشتیبان در بافت های نرم مانند کبد، مغز استخوان و بافت ها و اندام‌های سیستم لنفاوی عمل می کند. آنها معمولاً زیر اپیتلیوم قرار می گیرند و سطح سلول های عضلانی، سلول‌های چربی و سلول‌های شوان (Schwann) را می پوشانند. اختلال در روند سنتز و یا مقدار رتیکولین در بافت ها می تواند عامل ایجاد بیماری مانند فیبروز و سیروز کبدی گردد، بنابراین یکی از روش های تشخیص این بیماری ها مطالعه فیبرهای رتیکولین است.
انواع نمونه های بافتی تشخیصی و مورد مطالعه با رنگ آمیزی رتیکولین
رنگ‌آمیزی رتیکولین، یک تکنیک مهم در مطالعه ضایعات مؤثر بر بافت هایی مانند کبد، طحال، گره‌های لنفاوی و مغز استخوان است که ساختمان آنها غنی از رتیکولین است. این نمونه های بافتی می تواند بصورت تازه، فریز یا فیکس شده در فرمالین جهت انجام تکنیک رنگ رتیکولین استفاده گردد.
پروتکل اختصاصی رتیکولین
جهت انجام پروتکل رنگ آمیزی رتیکولین، ابتدا می بایست محلول نقره نیترات تهیه کنیم. ۵ سی سی از محلول نیترات نقره را در ظرف شیشه ای تیره ریخته و در حالی که روی استیرر میکس می شود، آمونیوم هیدروکسید را قطره قطره به محلول اضافه کرده تا رسوبات کاملا حل شود. پس از آن ۵ سی سی از محلول سدیم هیدروکساید ۳% را با احتیاط اضافه کرده و رسوب را مجدداً با هیدروکسید آمونیوم حل می کنیم تا زمانی که فقط یک کدری ضعیف مشاهده شود. سپس محلول حاصل را با آب مقطر تا ۵۰ میلی لیتر رقیق کنید و در یک شیشه تمیز فیلتر کنید.
مراحل آماده سازی لام از نمونه بافتی در رنگ آمیزی رتیکولین
پس از جدا نمودن بافت مورد نظر، جهت جلوگیری از فعالیت آنزیمی، بافت ها را در فرمالین ده درصد یا به‌صورت فریز شده فیکس می کنیم.
در مرحله بعد که پردازش بافتی است، بافت ها را در تیشوبسکت ها قرارداده و نام یا کد نمونه‌ها را روی تیشو بسکت‌ها می نویسیم.
آبگیری نمونه بافتی: اکنون می بایست آب موجود در نمونه‌های بافتی را حذف نموده، بنابراین از غلظت‌های افزایشی اتانول استفاده می شود یعنی اتانول جایگزین آب در بافت می گردد.
قالب گیری بافت: بلوک‌های پارافینی از نمونه‌های بافتی با پارافین جامد و طبق دستورالعمل های دستگاه پارافین دیسپنسر و دستگاه تیشو امبدینگ تهیه می کنیم.
برش‌گیری از بلوک پارافینی: پس از قالب‌گیری پارافینی نمونه بافتی، در این مرحله از نمونه فیکس شده در پارافین با دستگاه میکروتوم برش‌های نازک در حد ۴ الی ۵ میکرومتر آماده می کنیم.
آبدهی نمونه برش زده: برش های نمونه بافتی را روی لام قرار داده و پارافین اضافی نمونه را با دستگاه گرمکن اسلاید حذف می کنیم و با غلظت های کاهشی از اتانول نمونه بافتی را آبدهی می کنیم.
اکنون لام های آماده شده را طبق پروتکل رنگ‌آمیزی رنگ می کنیم.
مراحل رنگ آمیزی نمونه بافتی در رنگ آمیزی رتیکولین
ابتدا اسلایدهای آماده شده را در محلول پتاسیم پرمنگنات به مدت ۵ دقیقه قرار می دهیم و سپس به مدت دو دقیقه با آب مقطر شستشو می دهیم.
اسلایدها را در محلول اگزالیک اسید قرار داده تا برش های بافتی بی رنگ شود و با آب مقطر شستشوی مختصر می دهیم.
لام ها را به مدت حداقل ده دقیقه در محلول سولفات آمونیوم فریک انکوبه می کنیم و پس از آن سه بار با آب جار شسته و با آب مقطر آبکشی می کنیم.
اکنون روی هر اسلاید ۷ قطره محلول نیترات نقره اضافه کرده و محلول اضافی را با تکان دادن اسلایدها دور می ریزیم و نهایتا دو مرتبه سریع با آب مقطر شستشوی مختصر می‌دهیم.
لام ها را محلول فرمالین ده درصد به مدت ۳۰ تا ۱۲۰ ثانیه انکوبه کرده تا رنگ سیاه یا خاکستری مشاهده گردد و با آب مقطر آبکشی می کنیم.
لام‌ها را در ۰.۲٪ کلرید طلا به مدت حداقل ۱ دقیقه قرار داده تا رنگ پس زمینه زرد حذف گردد و با آب مقطر شستشو می دهیم.
نمونه ها را در محلول ۵% تیوسولفات سدیم به مدت یک دقیقه قرار داده تا نقره های احیا نشده حذف گردد.
پس از شستشوی با آب مقطر، جهت رنگ شدن هسته سلول ها، برش های بافتی را با محلول رنگ Nuclear Fast Red به مدت ۵ دقیقه انکوبه می کنیم و پس از شستشو با آب جاری، اجازه می دهیم برش های رنگ شده خشک شود.
لام ها را با لامل و چسب انتلان مونت نموده و نهایتا پس از اتمام مراحل رنگ‌آمیزی رتیکولین، لام های آماده شده را با میکروسکوپ نوری بررسی می کنیم.
تجهیزات و مواد آزمایشگاهی مورد نیاز برای تکنیک رنگ‌آمیزی رتیکولین
مواد مورد نیاز
محلول نیترات نقره
آمونیوم هیدروکساید
محلول سدیم هیدروکساید ۳%
پتاسیم پرمنگنات
اگزالیک اسید
سولفات آمونیوم فریک
کلرید طلا
محلول ۵% تیوسولفات سدیم
رنگ Nuclear Fast Red
آب مقطر
فرمالین ده درصد
پارافین جامد
اتانول مطلق
چسب انتلان
تجهیزات مورد نیاز
استیرر (همزن)
دستگاه تیشو امبدینگ
دستگاه پارافین دیسپنسر
دستگاه میکروتوم و تیغ میکروتوم
دستگاه گرمکن اسلاید
میکروسکوپ نوری
جار رنگ آمیزی لام و سبد رنگ آمیزی لام
لام و لامل
تیشو بسکت
تفسیر نتایج رنگ آمیزی رتیکولین
فیبرهای رتیکولین میل طبیعی کمی برای محلول های نقره دارند، بنابراین باید با پرمنگنات پتاسیم تیمار شوند تا نقاط حساس روی الیاف رتیکولین جهت رسوب نقره ایجاد شود. نقره به شکلی است که به راحتی می تواند به صورت نقره فلزی رسوب کند. یک عامل کاهشی (Reduction)، فرمالین، باعث رسوب نقره به شکل فلز می شود و نهایتاً یک رنگ سیاه خنثی با شدت زیاد ایجاد می کند. الیاف رتیکولوم در کبد، طحال و کلیه به وفور یافت می شود. در یک کبد نرمال، رتیکولین رشته های مشخص و منظمی هستند، اما کبد نکروزه و سیروز دارای الگوهای ناپیوسته هستند. رتیکولین همچنین الگوهای مشخصی را در ارتباط با سلول‌های تومور خاص تشکیل می دهد.
فیبروز مغز استخوان در انواع بیماری های بدخیم و غیر بدخیم دیده می شود، رسوب رتیکولین و فیبروز کلاژن در مغز استخوان بیماران مبتلا به میلوفیبروزیس به واسطه سلول بنیادی/پیش ساز خونساز میلوفیبروز ایجاد می شود و به اختلال کمک می کند.
نتیجه پروتکل رنگ آمیزی رتیکولین در زیر میکروسکوپ نوری بدین صورت است: در بک گراند صورتی رشته‌های رتیکولین به رنگ سیاه و هسته سلول‌های نمونه به رنگ قرمز مشاهده می‌گردد.
ارائه خدمات رنگ‌آمیزی رتیکولین در آزمایشگاه بافت شناسی
پاتولوژی (بافت شناسی) مطالعه میکروسکوپی بافت های حیوانی و گیاهی پس از رنگ آمیزی و بررسی آنها در زیر میکروسکوپ (الکترونی یا نوری) است. روش های مختلفی برای مطالعه ویژگی های بافتی و ساختار میکروسکوپی سلول ها استفاده می شود. مطالعات بافت شناسی در علوم تشریح، پزشکی قانونی، تحقیقات، تشخیص پزشکی و در آموزش کاربرد دارد. علاوه بر این، بافت شناسی به طور گسترده در پزشکی به ویژه در مطالعه بافت های بیمار برای کمک به درمان استفاده می شود. در هیستوپاتولوژی جهت آنالیز و تشخیص ساختار بافت‌های انسان و حیوانات آزمایشگاهی، نمون ه‌ها باید با روش ستاپ شده، رنگ آمیزی شوند.
یکی از انواع رنگ آمیزی های اختصاصی نمونه‌های بافتی، رنگ‌آمیزی اختصاصی فیبرهای رتیکولین در بافت‌های موجود زنده به نام رتیکولین است. در آزمایشگاه بافت‌شناسی شرکت بافت و ژن پاسارگاد با استفاده از تجهیزات و مواد آزمایشگاهی استاندارد، برش‌های میکرونی از نمونه‌های بافتی مختلف، تهیه و با تکنیک های رنگ‌آمیزی عمومی و اختصاصی از جمله رنگ آمیزی رتیکولین رنگ نموده و نهایتا به بررسی و مطالعه نمونه بافتی انسان و حیوانات آزمایشگاهی بیمار و سالم تعریف شده در طرح‌های پژوهشی محققان، اساتید و دانشجویان می پردازد.
جمع بندی
تاریخچه بافت شناسی نشان می دهد که تغییرات قابل توجهی در تکنیک های مورد استفاده برای رنگ آمیزی بافت شناسی از طریق سنجش های شیمیایی، زیست شناسی مولکولی و تکنیک های ایمونولوژیک، که در مجموع به عنوان هیستوشیمی نامیده می شود، وجود داشته است. بافت شناسان اولیه از مواد شیمیایی در دسترس برای آماده سازی بافت ها جهت مطالعات میکروسکوپی استفاده می کردند. این مواد شیمیایی دی کرومات پتاسیم، الکل و کلرید جیوه برای سخت شدن بافت های سلولی بودند. تکنیک های رنگ آمیزی مورد استفاده شامل نیترات نقره، گیمسا، رنگ آمیزی های تریکروم، رنگ آمیزی گرم و هماتوکسیلین بودند که تا به امروز چند رنگ آمیزی اختصاصی دیگر به مجوعه تکنیک های رنگ آمیزی بافت شناسی اضافه شده است. از جمله رنگ آمیزی رتیکولین که از نقره برای تشخیص فیبرهای رتیکولین استفاده می کند. رتیکولین های ساخته شده از کلاژن نوع ۳، در پس زمینه خاکستری تا صورتی روشن سیاه مشاهده می شوند. این رنگ آمیزی برای ارزیابی چنین فیبرهایی در بافت های کبد، مغز استخوان و کلیه استفاده می شود.
سوالات متداول
❔ رنگ آمیزی رتیکولین در پاتولوژی چه کاربردی دارد؟
✔️ از رنگ‌آمیزی رتیکولین جهت تشخیص و بررسی فیبرهای رتیکولین در بافت های مختلف حیوانات آزمایشگاهی و انسان استفاده می شود.
❔ کدام نمونه های بافتی مورد مطالعه با رنگ آمیزی رتیکولین قرار می گیرد؟
✔️ نمونه های بافتی حاوی رتیکولوم مانند کبد، طحال، مغز استخوان و کلیه با رنگ آمیزی رتیکولین مطالعه می شوند.