نمونه هایی مانند استخوان و دندان و به طور کلی بافت هایی که دارای رسوبات آهکی هستند باید پیش از فیکس شدن، دکلسیفیه شوند تا بتوان آن ها را برای مراحل بعدی آماده کرد. دکلسیفیکاسیون به معنی آزاد کردن مواد معدنی (کلسیم) از بافت های استخوانی بوده و شامل مراحل ذیل است:
معمولاً از استخوان دکلسیفیه برای مطالعه مغز استخوان به منظور تشخیص تومور و عفونت و سایر اهداف استفاده می شود. اگر ناحیه کلسیفیه در نمونه بافتی مورد نظر باشد، دستیابی به نمونه مطلوب بدون دکلسیفیکاسیون اولیه غیر ممکن است.
استخوان از سلول های استئوسیت، ماتریس کلاژن و کریستال های هیدروکسی اپاتیت تشکیل شده است که این کریستال ها در طی فرایند دکلسیفیکاسیون حل شده و در صورت صحیح انجام شدن آن باید پس از اتمام فرایند دکلسیفیکاسیون نمونه بافت استخوان از لحاظ فیزیکی مشابه بافت پیوندی فیبروز چگال باشد.
مدت زمان لازم برای دکلسینه کردن به نوع نمونه بستگی دارد اگر نمونه مورد نظر مغز استخوان باشد مدت زمان لازم یک ساعت بوده و یا اگر نمونه فمور باشد مدت زمان لازم یک ماه است. افزایش دما به فرایند سرعت می بخشد اما ممکن است به بافت آسیب برساند بنابراین باید احتیاط شود.
علاوه بر استخوان سایر بافت ها نیز مانند دیواره رگ های خونی و یا کلیه و شش نیز می توانند کلسینه شده و نیاز به عملیات دکلسیفیکاسیون قبل از پروسه آماده سازی بافت برای برش داشته باشند. برای نرم نمودن بافت استخوان نیمه سخت، می توان آن را در اسید استیک 10% قرار داد و به منظور نرم کردن بافت استخوان خیلی سخت می توان آن را در اسید نیتریک 10% قرار داد.
بهتر است قطاع 2/5 میلیمتری از بافت تهیه شود..
طبیعت نمونه دریافت شده مهم است و باید مورد توجه قرار گیرد چرا که برای تعیین زمان لازم برای دکلسیفیکاسیون و روش انجام آن، میزان استخوان اسفنجی و فشردگی نمونه حائز اهمیت است.
برای دستیابی به نتایج با کیفیت بالا تعیین نقطه ای که تمام کلسیم بافت خارج می شود مهم است زیرا ادامه بیش از حد فرایند به دلیل استفاده از اسیدهای قوی موجب آسیب دیدگی بافت و عدم تکمیل فرایند موجب عدم توانایی در برش بافت می شود. بهترین روش به خصوص برای نمونه های بزرگ مثل استخوان فمور، استفاده از آنالیز X-Ray است. این آنالیز کوچکترین کلسیم موجود را نیز مشخص می کند. تست شیمیایی تعیین وجود کلسیم استفاده از آمونیوم اگزالات است اگر کلسیم اگزالات تشکیل شود نشان دهنده لزوم ادامه یافتن فرایند دکلسیفیکاسیون می باشد. تست فیزیکی شامل خم کردن و دستکاری نمونه نیز می تواند استفاده شود البته نتایج این تست نمی توانند قابل اعتماد باشند و می توانند موجب آسیب دیدگی نمونه نیز بشوند.
تصویر 1 : مقطع عرضی از استخوان دراز دکلسیفیه شده و رنگ آمیزی شده توسط هماتوکسیلین ائوزین
تصویر 2: مقطع دکلسیفیه شده از استخوان اسفنجی (صورتی) و غضروف هیالین (آبی)
اما در صورتی که یک نارسایی استخوان متابولیکی مورد بررسی قرار گیرد و نیاز به تمایز استخوان معدنی (mineralized bone) از استئوید (osteoid) باشد و یا اندازه گیری های مورفولوژیک استخوان مد نظر باشد لازم است که قسمت معدنی استخوان حفظ گردد و برش از استخوان کلسیفیه صورت گیرد چون استخوان معدنی یک بافت بسیار سخت است روش های محدودی برای تهیه برش از آن وجود دارد. می توان بعد از فیکساسیون آن را به طور مستقیم بر روی یک صفحه سیلیکونی پهن کرد و توسط سطوح خشن آن را پودر نمود و مقطع پودری نازک مانند تصویر 3 تهیه نمود. یک راه حل دیگر آن است که نمونه های استخوان را از طریق آغشته سازی با رزین های آکریلیک یا اپوکسی تهیه کنیم تا بعد از پلیمریزاسیون، سختی مشابه با استخوان معدنی پیدا کنند سپس می توان برش هایی از نمونه آغشته شده را توسط میکروتوم های سنگین با تیغه هایی از جنس تنگستن کاربید یا الماس مانند شکل 4 تهیه نمود.
تصویر 3: یک مقطع پودر شده بدون رنگ آمیزی از استخوان فشرده همانطور که مشاهده می شود تعدادی از استئون ها (سیستم هاورس) به صورت عرضی بریده شده اند استئون ها شامل لایه های متحدالمرکز استخوان هستند که اطراف کانال هاورس شامل عروق خونی قرار گرفته اند داخل این لایه های استخوانی فضاهایی وجود دارد که شامل استئوسیت هستند. در مقطع های پودری خشک شده مانند شکل آن ها توسط ساختارهای سیاه رنگ مشخص شده اند.
تصویر 4: یک نمونه بدون دکلسیفیکاسیون از استخوان اسفنجی. استخوان در فرمالین فیکس شده و توسط رزین اپوکسی آغشته شده است استخوان کلسیفیه به رنگ سیاه مشخص شده و استئویدها بر روی استخوان تراباکولار به رنگ آبی رنگ آمیزی شده اند. مشاهده می کنیم که علی رغم حمایت رزین اپوکسی، ماتریس کلسیفیه هنگام تهیه برش ترک برداشته است.